刘美玲，黄俊★

广州医科大学，广州，511436

【摘要】 目的  运用实时荧光环介导等温扩增技术（Loop mediated isothermal amplication，LAMP ）建立一种快速准确检测淋球菌的方法，以期用于淋病的早期临床诊断。方法  以淋球菌 porA为靶基因，设计保守性和特异性良好的引物，以淋球菌标准菌株基因组 DNA 为模板，进行LAMP 扩增，用23种其他在生殖系统中存在的微生物验证其灵敏度和特异性。结果  实时荧光LAMP 法可检测到1pg/μL（10³ CFU/ml）淋球菌基因组DNA,稳定性良好，其针对23种其他在生殖系统中存在的微生物均不能扩增，porA引物对淋球菌高度特异，阳性结果15分钟可快速检出。结论  已成功建立了检测淋球菌 porA的 LAMP 技术，为淋球菌的快速检测提供了新的手段，有望成为淋球菌常规检测的简便方法。

【关键词】  淋球菌，porA基因，环介导等温扩增技术

      淋病多表现为泌尿生殖系统的化脓性炎症，若不及时治疗，可引起前列腺炎、精囊炎、附睾炎或子宫内膜炎、输卵管炎，慢性淋病更可导致粘膜坏死，引起尿道狭窄、输精管及输卵管狭窄甚或闭锁，继发宫外孕和男女不孕不育症。淋病传播快，潜伏期难以确定，因约60%患者无症状，尤其是妇女患者多数为无症状的带菌者。淋病的病原体是淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae），又称淋病双球菌、淋球菌、淋菌，是一种革兰氏阴性双球菌。目前临床上的诊断技术主要有涂片染色直接显微镜观察淋球菌细胞形态和分离培养淋球菌两种方法，涂片染色法对检测者的经验有较高要求，容易漏诊，分离培养法假阴性高，操作复杂且耗时长。快速准确的诊断方法可以使患者早确诊早治疗，避免在人群中进一步传播和持续存在。环介导等温扩增（Loop mediated isothermal amplication，LAMP ）技术是 2000 年 Notomi 等报道的一种新型核酸扩增技术[1]，针对靶序列上 6 或 8 个特异区域设计4 或 6 条特异引物，具有链置换活性的Bst DNA 聚合酶快速扩增目的片段，产生具有茎环结构，大小不等的 DNA 片段混合物。近年来，LAMP技术得到广泛的应用，其检测方法也出现不断的变革，目前常用的方法有浊度法、电泳法、钙黄绿素法等，为避免开盖检测，同时为缩短检测时间，本研究在反应体系中加入饱和染料，建立一种闭管和恒温荧光实时检测的方式。淋球菌 porA基因稳定性和特异性良好，本研究针对淋球菌 porA基因设计特异引物，运用恒温荧光LAMP技术对淋球菌实现特异、快速检测。

 

1.   菌株来源

淋球菌标准菌株购自卫生部临床检验中心，铜绿假单胞菌、大肠杆菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、阴沟肠杆菌、表皮葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、草绿色链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷白杆菌、溶血性葡萄球菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌、无名念珠菌、季页蒙念珠菌、解脂酵母菌、克柔念珠菌、挪威念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、乳酸杆菌、灰色奈瑟氏菌、大肠埃希菌、奇异变形杆菌、彭氏变形杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌为本实验室保存。

2.   主要试剂

Bst DNA 聚合酶为New England Biolabs公司产品；甜菜碱(Betaine)和MgCl₂为Sigma公司产品；SYTO-9为Invitrogen 公司产品； DNA marker dNTP为宝生物工程（大连）有限公司产品；细菌基因组提取试剂盒为天根生化科技（北京）有限公司产品；其余试剂均为国产分析纯。

3.   细菌总DNA提取

参照细菌基因组提取试剂盒说明书，用蛋白酶K裂解细胞，RnaseA去除RNA，结合柱吸附DNA，TE洗脱DNA。

4.   淋球菌标准菌株porA基因的检测

根据LAMP技术原理，在NCBI中进行porA基因的比对，选取保守性高、特异性强的片段作为靶序列，使用在线设计软件Primer Explorer v4设计引物，引物为PAGE级，由Invitrogen 公司合成，引物序列见表1。25 μL的LAMP反应体系成分包括：FIP和BIP各1.6 µM，F3和B3各0.2 µM，FLP和BLP各0.8 μM，20 mM Tris-HCl(PH8.8)，10 mM KCl，8 mM MgSO₄，10 mM (NH₄)₂SO₄，0.1% Tween20，1 M甜菜碱，6 mM MgSO₄，1.6 mM dNTP，8 U Bst大片断DNA聚合酶，0.5 µl SYTO-9，2 µl DNA。具体操作时先在冰上准备LAMP反应混合液，扩增反应体系如下：12.5 μL反应液RM，8 μL超纯水DW，1 μL引物PM，1 μL Bst酶，0.5 µl SYTO-9以及2 μL模板。将除模板外其他试剂配备成混合液混匀后，每管分装23 μL，再分别加入2 μL模板DNA或阴阳性对照模板，参照荧光PCR仪使用说明书，设置反应程序为：Holding Stage为 63℃ 30 s，1个循环；Cycling Stage 为63℃ 15 s，63℃ 45 s，90个循环，于63℃ 45 s处收集荧光信号。

6.   检测porA基因的特异性

用铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、白色念珠菌（Candida albicans）、光滑念珠菌（Candida glabrata）、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、草绿色链球菌（Viridans Streptococci）、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus )、肺炎克雷白杆菌(Klebsiella pneumoniae)、肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）、结核分枝杆菌(Mycobacterium  tuberculosis)、季页蒙念珠菌（Candida guilliermondii）、解脂酵母菌（Candida lipolytica）、克柔念珠菌（Candida krusei）、挪威念珠菌（Candida norvegensis）、光滑念珠菌（Candida glabrata）、近平滑念珠菌（Candida parapsilosis）、灰色奈瑟氏菌（Neisseria cinerea）、大肠埃希菌(Escherichia coli )、奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）、彭氏变形杆菌Proteus  penneri)、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、屎肠球菌（Enterococcus faecium)的DNA作为LAMP反应的模板进行LAMP反应，参照荧光PCR仪使用说明书，设置反应程序为：Holding Stage为 63℃ 30 s，1个循环；Cycling Stage 为63℃ 15 s，63℃ 45 s，45个循环，于63℃ 45 s处收集荧光信号，验证LAMP反应的特异性，利用荧光定量PCR仪观察反应结果。

 

1.   淋球菌标准菌株porA基因的检测

图1所示，以淋球菌基因组DNA（10ng/μl）为模板扩增porA基因的出峰时间为10min，阴性对照没有扩增。

图1 porA基因的检测

Fig1 detection of porA

2.   LAMP检测porA基因的灵敏度

从图2可以看出，将淋球菌基因组DNA稀释至不同浓度梯度，porA作为LAMP引物进行LAMP扩增，出峰时间和浓度梯度呈明显梯度变化，检测灵敏度可达1pg/μL，对应的细菌浓度为1× 10³ CFU/ml，最低检出限出峰时间约在17 min，阴性对照没有扩增。

 

图2 LAMP检测 porA基因的灵敏度

Fig2 Sensitivity of LAMP for detection of porA

3.   LAMP检测porA基因的特异性

图3显示，porA引物只对淋球菌特异性检出，阴性对照和其他23种菌均没有扩增。

图3 LAMP检测 porA基因的特异性

Fig3 Specificities of LAMP for detection of porA

 

淋球菌培养的苛刻条件为临床常规检测带来了挑战，近年在淋球菌的诊断方面有了很多改进，通过检测临床样品中的淋球菌DNA来进行诊断已经应用的越来越广泛[2, 3]。目前有porA、ccpB、opa、胱氨酸DNA甲基转移酶基因及16S rRNA基因作为淋球菌检测的靶基因[4]，其中16S rRNA会与干燥奈瑟菌(N. sicca)有交叉反应[5]，而porA基因具有较高的特异性，且在淋球菌的不同菌株中又很保守[3, 6]，不同的引物序列可以增进扩增反应的特异性。由于porA基因在淋球菌基因组中只有一个拷贝，灵敏度比起其他基因可能低十倍左右[7, 8]，增加扩增循环数，改进反应条件可以相应提高灵敏度。

在分子检测中，LAMP 技术可以达到与 PCR 技术同样的灵敏度和特异性，而且操作简单快速，仅需一台恒温水浴箱即可完成反应，检测方法也简便多样，分为常规核酸检测和直观检测，常规检测包括电泳分析和荧光定量检测，常规电泳后用EB或SYBR GreenⅠ染色，在凝胶上出现的是从点样孔开始由大小不同的区带组成的连续阶梯式图谱。通过荧光检测仪实时检测荧光强度，并与标准模板的扩增比较，可以实现扩增的实时定量检测。直观检测包括焦磷酸镁浊度检测和荧光目测比色。在DNA大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合， 产生副产物焦磷酸镁白色沉淀， 出现肉眼可见的浑浊。其浊度的大小与DNA的含量成正比例，且具有极高的特异性，因此只要用肉眼观察其浑浊情况，就能够判断是否发生DNA扩增[9, 10]。荧光目测可以直接在LAMP反应体系内加入荧光增补染料，如SYBR GreenⅠ，如果存在扩增产物，肉眼可以观察到溶液变绿色，如无扩增，溶液则为橙色，从而直接判断是否发生扩增反应[11]，在LAMP反应体系中加入预先混合的钙黄绿素和锰离子，在反应开始前锰离子与钙黄绿素结合，起猝灭钙黄绿素荧光信号的作用。扩增反应产生的焦磷根离子可以跟锰离子结合，并把锰离子从钙黄绿素上释放下来，从而使钙黄绿素恢复荧光。同时体系中的Mg²⁺与钙黄绿素结合，进一步加强钙黄绿素的荧光。在紫外灯的照射下，发生DNA扩增反应的管可以明显看到钙黄绿素发出的绿蓝色荧光[12]。

本研究采用恒温荧光法，不仅实现闭管检测，减少因开盖造成的假阳性，同时可实时监测反应的过程，便于结果的判断。本研究运用LAMP技术，以porA为靶基因进行扩增，实现淋球菌的分子检测，灵敏度达到1pg/μL (约1× 10³ CFU/ml)，对23种其他在生殖系统中存在的微生物无扩增，而对淋球菌DNA高度特异。最低检出限约17 分钟可检出，加上样品准备的时间，检测可在半小时内完成，这大大利于医院的现场诊断。另外反应在恒温下进行，不存在升降温引起的时间丢失，与PCR技术比，可以不要昂贵的热循环仪，加上方便快捷的阴阳性判断，此方法有望成为淋球菌检测的常规手段，应用于设备配备不高的基层医院。

最新研究表明，作为分子检测的样品，阴道拭子比子宫颈拭子和尿液效果更佳[13]，伴随着检测实验的快速化和简便化，检测仪器和试剂的系统化[14]，患者在家对性病进行自我筛查将有望实现。